PCR技术的原理是什么
PCR技术的原理是什么的答案是:PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。
温度与时间的设置
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40 ~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
PCR反应特点
特异性强 PCR反应的特异性决定因素为:
①引物与模板DNA特异正确的结合;
②碱基配对原则;
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;
④靶基因的特异性与保守性。
操作步骤
(1)变性:双链DNA在94℃条件下,通过热变性使模板的双链DNA氢键断裂变成单链。
(2)复性:当变性温度突然降至引物Tm值(通常为35~65℃)以下时,会使引物与模板DNA互补序列杂交。由于引物一般由10~25个碱基序列,模板DNA结构远比引物分子复杂,且反应体系中引物分子的浓度又远大于模板DNA,故在退火温度时,引物与模板DNA容易结合形成互补链。
(3)延伸:在DNA聚合酶的作用下,以DNA为模板和以4种脱氧核糖核苷酸为原料,在Mg2+存在的条件下。DNA聚合酶依赖于其5'→3'的聚合酶活力,以引物结合于DNA模板链为起始点。使引物的序列得以延伸,合成模板DNA的互补链。
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