pcr中引物的作用
pcr中引物的作用:找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列,一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补,另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。在PCR(聚合酶链式反应)技术中,已知一段目的基因的核苷酸序列,根据这一序列合成引物,利用PCR扩增技术,目的基因DNA受热变性后解链为单链,引物与单链相应互补序列结合,然后在DNA聚合酶作用下进行延伸,如此重复循环,延伸后得到的产物同样可以和引物结合。
1、扩展资料PCR引物设计PCR反应中有两条引物,即5′端引物和3′引物。
2、设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
3、引物设计的基本原则:引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。
4、引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。
5、ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
6、引物内部不应出现互补序列。
7、两个引物之间不应存在互补序列,尤其是避免3 ′端的互补重叠。
8、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%,引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列,否则易导致非特异性扩增。
9、引物3‘端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,最佳选择是G和C。
10、引物的5′端可以修饰。
11、如附加限制酶位点,引入突变位点,用生物素、荧光物质、地高辛标记,加入其它短序列,包括起始密码子、终止密码子等。
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